G530011O06Rik Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-437289-ACT

O gene murino G530011O06Rik codifica a proteína G530011O06Rik, um fator pouco caracterizado, com anotação funcional limitada nas bases de dados atuais de vias. As evidências disponíveis sugerem que ele pode participar de processos celulares fundamentais, como regulação transcricional, metabolismo de RNA ou outros programas regulatórios dependentes do contexto, o que o torna relevante para estudos em nível de sistema sobre a arquitetura de redes gênicas. Como genes da coleção de cDNA do RIKEN frequentemente representam transcritos responsivos à linhagem celular ou a estímulos, modular a expressão de G530011O06Rik pode ajudar a esclarecer transições de estado celular, respostas ao estresse e programas de desenvolvimento. Definir sua função endógena pode informar pesquisas mecanísticas em modelos relevantes para doenças em que a desregulação da expressão gênica contribui para fenótipos patológicos, sem implicar utilidade clínica.

G530011O06Rik O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de G530011O06Rik sem alterar a sequência de ADN subjacente.

G530011O06Rik O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus G530011O06Rik em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição G530011O06Rik, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de G530011O06Rik. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus G530011O06Rik nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de G530011O06Rik no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via G530011O06Rik em células tumorais com expressão de G530011O06Rik silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.