Fumarylacetoacetase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402478-ACT

FAH codifica a fumari lacetoacetase humana, uma enzima citosólica que catalisa a etapa terminal do catabolismo da tirosina, hidrolisando o fumari lacetoacetato em fumarato e acetoacetato. Essa reação conecta a degradação de aminoácidos aromáticos ao metabolismo central do carbono por meio da produção de precursores do ciclo do TCA e de corpos cetônicos, e ajuda a prevenir o acúmulo de intermediários reativos que podem modificar macromoléculas celulares. A atividade interrompida de FAH está associada à tirosinemia hereditária tipo I e é amplamente usada como modelo de estresse metabólico em hepatócitos, respostas a danos no DNA e sistemas de seleção específicos do fígado em contextos experimentais. Assim, FAH serve como um nó-chave para estudar o fluxo de vias metabólicas, a capacidade de desintoxicação e a homeostase dos hepatócitos.

Fumarylacetoacetase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FAH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Fumarylacetoacetase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FAH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FAH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Fumarylacetoacetase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FAH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Fumarylacetoacetase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Fumarylacetoacetase em células tumorais com expressão de FAH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.