FOXD3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402673-ACT

FOXD3 (forkhead box D3) ist ein Transkriptionsfaktor der Forkhead-Familie, der zentrale Rollen bei der frühen embryonalen Musterbildung, der Spezifikation der Neuralleiste und der Aufrechterhaltung pluripotenzassoziierter transkriptioneller Zustände spielt. Durch die Koordination der Linienfestlegung und die Unterdrückung vorzeitiger Differenzierungsprogramme ist FOXD3 in entwicklungsbezogene genregulatorische Netzwerke eingebunden, die sich mit Chromatin-Remodeling sowie Stammzell-Signalwegen überschneiden. Eine fehlregulierte FOXD3-Expression wird mit einer veränderten Kontrolle von Zellschicksalen, Tumorzellplastizität und stressadaptiven Transkriptionsprogrammen in Verbindung gebracht, was FOXD3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Mechanismen der Metastasierung, Therapieresistenz und Entwicklungsstörungen macht. In humanen Modellsystemen wird die FOXD3-Aktivität häufig im Kontext von Dynamiken der Transkriptionsrepression/-aktivierung, der Enhancer-Nutzung und der epigenetischen Kontrolle von Linienverläufen untersucht.

FOXD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FOXD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FOXD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FOXD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FOXD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FOXD3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FOXD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FOXD3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FOXD3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FOXD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.