Plasmide CRISPR d'Activation (h) FANCA: sc-403205-ACT

FANCA code un composant central de la voie de réparation de l’ADN de l’anémie de Fanconi (FA), qui coordonne la réparation des pontages interbrins de l’ADN et stabilise les fourches de réplication pendant la phase S. FANCA participe au complexe central FA, lequel favorise la mono-ubiquitination de FANCD2 et de FANCI, permettant ensuite le traitement nucléolytique en aval et une réparation associée à la recombinaison homologue. La perturbation de FANCA compromet l’intégrité du génome, augmente les cassures chromosomiques et sensibilise les cellules aux dommages induits par les agents de pontage, reliant ce gène à la pathologie moléculaire de l’anémie de Fanconi ainsi qu’à des mécanismes plus larges de stress réplicatif. Par conséquent, FANCA est largement étudié dans les voies qui régissent la signalisation des dommages à l’ADN, les points de contrôle du cycle cellulaire et le maintien de la stabilité chromosomique.

FANCA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FANCA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FANCA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FANCA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FANCA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FANCA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FANCA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FANCA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FANCA dans les cellules tumorales présentant une expression de FANCA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.