ENT4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405115-ACT

O gene humano SLC29A4 codifica o transportador nucleosídico equilibrativo 4 (ENT4), um transportador de membrana plasmática que facilita o fluxo bidirecional de adenosina e nucleosídeos relacionados, com atividade de transporte influenciada pelo pH extracelular. Ao modular a disponibilidade de nucleosídeos, o ENT4 pode afetar o metabolismo de salvamento de purinas e redes de sinalização de adenosina extracelular que moldam respostas celulares ao estresse e sinais inflamatórios. A atividade do ENT4 tem sido investigada em contextos nos quais a homeostase da adenosina está perturbada, incluindo processos cardiometabólicos e neurobiológicos. A expressão alterada de SLC29A4 também é relevante para estudos de fenótipos monoaminérgicos e ligados a nucleosídeos, sustentando seu uso como alvo no mapeamento de vias e em genômica funcional.

ENT4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC29A4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ENT4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC29A4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC29A4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ENT4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC29A4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ENT4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ENT4 em células tumorais com expressão de SLC29A4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.