eIF2α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400199-ACT

EIF2S1 kodiert die alpha-Untereinheit des humanen eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2 (eIF2α), einen zentralen Regulator der Initiation der mRNA-Translation und der Proteostase. Die Phosphorylierung von eIF2α an Ser51 integriert Signale der integrierten Stressantwort (ISR) über Kinasen wie PERK, GCN2, PKR und HRI, wodurch die globale Proteinsynthese verringert wird, während selektive Translationsprogramme wie etwa ATF4 begünstigt werden. Auf diese Weise verknüpft EIF2S1 ER-Stress, Nährstoffmangel, virale Erkennung und oxidativen Stress mit adaptiven transkriptionellen und metabolischen Umprogrammierungen. Eine fehlregulierte eIF2α-Signalübertragung wird in unterschiedlichen Kontexten wie Neurodegeneration, Stresstoleranz von Krebszellen und inflammatorischer Pathophysiologie beschrieben, wodurch die Modulation von EIF2S1 für die Aufklärung von Signalwegen nützlich ist.

eIF2α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EIF2S1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

eIF2α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EIF2S1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EIF2S1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen eIF2α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EIF2S1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von eIF2α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des eIF2α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EIF2S1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.