EGFR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400015-ACT

Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist eine humane Rezeptor-Tyrosinkinase, die nach ligandeninduzierter Dimerisierung und Autophosphorylierung Signalkaskaden auslöst, welche Zellproliferation, Überleben, Differenzierung und Migration steuern. EGFR aktiviert zentrale Signalwege wie RAS–RAF–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR, PLCγ–PKC und JAK–STAT und verknüpft dabei extrazelluläre Wachstumssignale mit transkriptionellen und metabolischen Programmen. Eine fehlregulierte EGFR-Expression oder -Signalübertragung ist häufig mit einer veränderten epithelialen Homöostase und onkogenen Phänotypen assoziiert und macht EGFR zu einem zentralen Knotenpunkt in der Wachstumsfaktor-Rezeptorbiologie. EGFR wird zudem широко als Modellrezeptor verwendet, um Rezeptor-Trafficking, Endozytose, Feedback-Regulation und Pathway-Cross-talk in humanen Zellsystemen zu untersuchen.

EGFR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EGFR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EGFR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EGFR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EGFR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EGFR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EGFR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EGFR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EGFR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EGFR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.