Dysbindin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404547-ACT

DTNBP1 codifica la disbindina 1, un componente del complesso 1 di biogenesi degli organelli correlati ai lisosomi (BLOC-1), che supporta il traffico endosomiale, la biogenesi delle vescicole e la secrezione regolata. Nei neuroni, la disbindina 1 contribuisce alla dinamica delle vescicole sinaptiche e al rilascio di neurotrasmettitori, collegandola a vie che controllano la plasticità sinaptica e lo smistamento intracellulare delle proteine. Alterazioni dell’espressione o della funzione di DTNBP1 sono state associate a fenotipi neuropsichiatrici e a processi cognitivi, e i difetti di traffico legati alla disbindina sono rilevanti per lo studio dell’omeostasi cellulare. Questo gene viene quindi utilizzato come punto di accesso meccanicistico per indagare il traffico di membrana, la funzione sinaptica e le risposte trascrittomiche a valle in sistemi modello umani.

Dysbindin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DTNBP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dysbindin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DTNBP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DTNBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dysbindin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DTNBP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dysbindin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dysbindin nelle cellule tumorali con espressione di DTNBP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.