DOT1L1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403286-ACT

A DOT1L humana (DOT1L1) codifica uma metiltransferase de lisina em histonas que catalisa a mono-, di- e trimetilação de H3K79, uma marca epigenética associada à transcrição ativa no corpo dos genes. A regulação da cromatina dependente de DOT1L sustenta o alongamento pela RNA polimerase II, a comunicação entre enhancers e promotores e a coordenação da sinalização de danos ao DNA com a progressão do ciclo celular. Por meio do controle de programas transcricionais específicos de linhagem, a DOT1L influencia a diferenciação hematopoética e redes gênicas mais amplas do desenvolvimento. A atividade desregulada de DOT1L e estados alterados de metilação de H3K79 estão associados ao desarranjo transcricional observado na leucemia e em outros cânceres, bem como a efeitos dependentes do contexto sobre a estabilidade do genoma.

DOT1L1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DOT1L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DOT1L1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DOT1L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DOT1L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DOT1L1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DOT1L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DOT1L1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DOT1L1 em células tumorais com expressão de DOT1L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.