Dnmt2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420034-ACT

Trdmt1 codifica a Dnmt2, uma metiltransferase de citosina-5 evolutivamente conservada que metila principalmente tRNAs específicos (notadamente em C38), em vez de DNA genômico, sustentando a integridade dos tRNAs, a fidelidade de decodificação e a adaptação celular ao estresse. Por meio da regulação da metilação de RNA, a Dnmt2 se conecta a vias de processamento de RNA e de controle da tradução que influenciam a proteostase e as respostas de crescimento. Alterações na atividade de TRDMT1/DNMT2 têm sido associadas a programas desregulados de metilação de RNA ligados à biologia tumoral, às respostas a infecções virais e a fenótipos celulares relacionados ao estresse. Em sistemas murinos, Trdmt1 fornece um modelo acessível para dissecar mecanismos epitranscriptômicos que acoplam a modificação de RNA a transições de estado celular e à estabilidade do genoma.

Dnmt2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Trdmt1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dnmt2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Trdmt1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Trdmt1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dnmt2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Trdmt1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dnmt2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dnmt2 em células tumorais com expressão de Trdmt1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.