DNA pol θ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407414-ACT

POLQ kodiert die DNA-Polymerase Theta (DNA-Pol θ), eine fehleranfällige Polymerase der A-Familie mit helikaseähnlicher Aktivität, die eine zentrale Rolle beim mikrohomologievermittelten End-Joining (MMEJ) spielt, auch als Polymerase-Theta–vermitteltes End-Joining (TMEJ) bezeichnet. DNA-Pol θ unterstützt die Reparatur von Doppelstrangbrüchen und trägt zur Toleranz gegenüber Replikationsstress bei, indem sie über alternative DNA-Endverknüpfungswege die Genomstabilität beeinflusst, die insbesondere dann zum Einsatz kommen, wenn das klassische NHEJ oder die homologe Rekombination beeinträchtigt sind. Die POLQ-Aktivität wurde mit Mutationssignaturen und chromosomalen Umlagerungen im Zusammenhang mit DNA-Schadensantworten in Verbindung gebracht und ist daher relevant für Studien zur genomischen Instabilität, zu replikationsassoziierten Läsionen und zur Wegwahl bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen. Aus diesem Grund wird POLQ häufig im Kontext von DNA-Reparaturmechanismen, synthetisch-letalen Interaktionen und Modellen krankheitsassoziierter DNA-Schadensphänotypen untersucht.

DNA pol θ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLQ-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol θ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLQ-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLQ-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol θ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLQ-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol θ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol θ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLQ-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.