DNA Ligase I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402830-ACT

O LIG1 humano codifica a DNA ligase I, uma ligase dependente de ATP que sela quebras de fita simples e une fragmentos de Okazaki durante a replicação do DNA na fita retardada. Essa enzima é um componente central da replicação do DNA e de múltiplas vias de reparo do DNA, incluindo o reparo por excisão de bases e o processamento de intermediários de reparo gerados durante a manutenção do genoma. Em coordenação com PCNA, FEN1 e outros fatores do replissomo e do reparo, a DNA ligase I sustenta a progressão da forquilha de replicação e preserva a estabilidade cromossômica. A desregulação de processos ligados ao LIG1 pode contribuir para estresse replicativo e fenótipos de instabilidade genômica frequentemente estudados na biologia do câncer e na pesquisa de resposta a danos no DNA.

DNA Ligase I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LIG1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA Ligase I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LIG1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LIG1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA Ligase I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LIG1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA Ligase I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA Ligase I em células tumorais com expressão de LIG1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.