Dkk-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406386-ACT

O DKK4 humano codifica a proteína 4 relacionada a Dickkopf (Dkk-4), um modulador secretado da sinalização Wnt que influencia a transcrição dependente de β-catenina e programas a jusante que controlam proliferação, diferenciação e organização do tecido epitelial. Ao interagir com co-receptores de Wnt e ajustar a saída da via, a Dkk-4 pode alterar decisões de destino celular e respostas de remodelamento em contextos do desenvolvimento e também no adulto. A expressão desregulada de DKK4 tem sido associada a alterações na atividade da via Wnt em diversos cenários relevantes para doenças, incluindo biologia tumoral e fibrose tecidual, nos quais mudanças no equilíbrio de sinalização afetam invasão, fenótipos semelhantes aos de células-tronco e interações com o microambiente. Como um nó da via, o DKK4 é frequentemente estudado por seu papel no crosstalk com a sinalização de fatores de crescimento e na regulação de gradientes extracelulares de sinalização.

Dkk-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DKK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dkk-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DKK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DKK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dkk-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DKK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dkk-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dkk-4 em células tumorais com expressão de DKK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.