DENND5B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-414817-ACT

DENND5B codifica uma proteína que contém um domínio DENN, implicada na regulação do tráfego de membranas dependente de GTPases Rab, ajudando a coordenar o brotamento de vesículas, o transporte endossomal e a sinalização compartimentalizada. Ao influenciar o ciclo de pequenas GTPases e a triagem de cargas, a DENND5B pode afetar a renovação de receptores, a localização intracelular de proteínas e processos celulares mais amplos, como polaridade e proliferação. A expressão alterada ou a disrupção de reguladores de tráfego como a DENND5B tem sido associada a redes de sinalização desreguladas e a alterações genômicas/funcionais observadas em diferentes contextos de doenças humanas, incluindo fenótipos relacionados ao câncer. Como resultado, a DENND5B é frequentemente estudada em vias que conectam a dinâmica do endomembrana ao controle do estado celular e à adaptação ao estresse.

DENND5B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DENND5B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DENND5B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DENND5B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DENND5B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DENND5B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DENND5B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DENND5B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DENND5B em células tumorais com expressão de DENND5B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.