Deltex-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404446-ACT

O DTX1 humano codifica a Deltex-1, uma ligase de ubiquitina E3 que atua como um modulador-chave da sinalização do receptor Notch e de programas transcricionais a jusante que governam decisões de destino celular, diferenciação e regulação imune. Por meio do controle dependente de ubiquitina de componentes da via Notch, a Deltex-1 influencia a duração e a intensidade do sinal, interagindo com a proteostase e com redes regulatórias de transcrição. Alterações na atividade de DTX1/Deltex-1 têm sido associadas a contextos de sinalização Notch desregulada relevantes para a biologia de células hematopoéticas e imunes, e são frequentemente investigadas em modelos de reprogramação de vias oncogênicas e de sinalização inflamatória. Essas propriedades tornam o DTX1 um alvo útil para estudos mecanísticos que conectam a ubiquitinação a fenótipos dependentes de vias.

Deltex-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DTX1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Deltex-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DTX1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DTX1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Deltex-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DTX1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Deltex-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Deltex-1 em células tumorais com expressão de DTX1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.