DDB2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401686-ACT

Il gene umano **DDB2** codifica un fattore di riconoscimento del danno al DNA che, insieme a **DDB1**, forma il complesso **UV-DDB**, agendo a monte della ligasi E3 dell’ubiquitina **CUL4A–RBX1** per avviare la riparazione per escissione di nucleotidi dell’intero genoma (global genome NER). Legandosi ai dimeri di pirimidina ciclobutano indotti dai raggi UV e ai fotoprodotti 6-4, DDB2 promuove la verifica della lesione, il rimodellamento della cromatina e il reclutamento dei componenti NER a valle, sostenendo così la stabilità del genoma e le risposte dei checkpoint del ciclo cellulare. L’attività di DDB2 interseca la proteostasi mediata dall’ubiquitina e le vie di riparazione del DNA accoppiate alla trascrizione, influenzando la sensibilità cellulare allo stress genotossico. Un’alterata regolazione di DDB2 è stata associata a una capacità difettosa di riparazione del DNA e all’accumulo di mutazioni rilevanti per la biologia del cancro e per fenotipi legati alla fotosensibilità, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici della segnalazione del danno al DNA.

DDB2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDB2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDB2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDB2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDB2 nelle cellule tumorali con espressione di DDB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.