DDB1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-419966-LAC

Il DDB1 murino (damage specific DNA binding protein 1) è un componente centrale del complesso ligasi E3 dell’ubiquitina CUL4–DDB1, che coordina l’ubiquitinazione dei substrati per regolare il turnover proteico lungo il ciclo cellulare. Partecipa alla riparazione per escissione di nucleotidi e alle risposte al danno del DNA associate alla replicazione, collegando lesioni associate alla cromatina alla segnalazione ubiquitina-dipendente e alla proteostasi. Attraverso interazioni con i recettori di substrato DCAF, DDB1 contribuisce a governare il rimodellamento della cromatina, il licensing della replicazione e il controllo dei checkpoint. La deregolazione dell’ubiquitinazione dipendente da DDB1 e delle vie di mantenimento del genoma è rilevante per studi sullo stress oncogenico, fenotipi dello sviluppo e difetti di riparazione del DNA associati alla neurodegenerazione in modelli murini.

Le particelle di attivazione lentivirale DDB1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Ddb1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale DDB1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Ddb1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di DDB1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Ddb1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.