dCK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417715-ACT

O DCK humano codifica a desoxicitidina quinase (dCK), uma enzima limitante da via de recuperação de nucleosídeos que fosforila a desoxicitidina e desoxinucleosídeos relacionados para suas formas monofosfato, sustentando pools equilibrados de dNTPs para replicação e reparo do DNA. A atividade da dCK conecta o metabolismo de nucleotídeos à progressão do ciclo celular, às respostas ao estresse replicativo e à manutenção do genoma, particularmente em tecidos proliferativos. A expressão ou atividade desregulada de DCK tem sido associada a alterações na homeostase de nucleotídeos e a vulnerabilidades metabólicas observadas em tumores hematológicos e sólidos, sendo frequentemente estudada em relação à diferenciação celular e à adaptação ao estresse. Como um nó central no metabolismo de nucleosídeos, o DCK é um alvo útil para investigar a comunicação entre vias com a função mitocondrial, o estado redox e a sinalização de dano ao DNA.

dCK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DCK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

dCK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DCK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DCK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de dCK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DCK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de dCK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via dCK em células tumorais com expressão de DCK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.