CUL-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400972-ACT

Il gene umano **CUL1** codifica la cullina-1 (CUL-1), un’impalcatura centrale dei complessi di ubiquitina ligasi E3 di tipo SCF (SKP1–CUL1–F-box), che coordinano il riconoscimento dei substrati e il trasferimento di ubiquitina per regolare il turnover proteasomiale. Controllando la stabilità di regolatori chiave del ciclo cellulare e della segnalazione, quali cicline, inibitori delle CDK e componenti delle vie di NF-κB e Wnt, CUL-1 contribuisce a mantenere una progressione ordinata attraverso le transizioni G1/S e i programmi trascrizionali dipendenti dai segnali. L’attività di CUL-1 è modulata da cicli di neddilazione/deneddilazione, collegandola a una regolazione dinamica della proteostasi mediata dall’ubiquitina. La deregolazione dell’ubiquitinazione dipendente da SCF/CUL1 è stata associata a proliferazione aberrante, instabilità genomica e segnalazione infiammatoria alterata in molteplici contesti rilevanti per la patologia.

CUL-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CUL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CUL-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CUL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CUL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CUL-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CUL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CUL-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CUL-1 nelle cellule tumorali con espressione di CUL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.