CPS1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402014-ACT

Il gene CPS1 umano codifica la carbamoil-fosfato sintetasi 1, un enzima mitocondriale che catalizza il primo passaggio irreversibile del ciclo dell’urea convertendo ammoniaca e bicarbonato in carbamoil fosfato utilizzando ATP. Questa attività è centrale per lo smaltimento epatico dell’azoto e si interseca con il catabolismo degli amminoacidi, il metabolismo mitocondriale e la biosintesi a valle dell’arginina. Un’espressione o una funzione alterata di CPS1 è associata a iperammoniemia e a una più ampia disregolazione metabolica, e lo stato di CPS1 viene frequentemente valutato in studi sulla fisiologia epatica, sulle risposte allo stress mitocondriale e sul bilancio dell’azoto. Nella ricerca oncologica e metabolica, CPS1 è inoltre utilizzato come marcatore dipendente dal contesto della riprogrammazione metabolica e dell’attività del ciclo dell’urea associata alla linea cellulare.

CPS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CPS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CPS1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CPS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CPS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CPS1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CPS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CPS1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CPS1 nelle cellule tumorali con espressione di CPS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.