COPA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404020-ACT

COPA kodiert die Alpha-Untereinheit des Coatomer-Komplexes I (COPI), einem zentralen Vermittler des vesikulären Transports zwischen dem Golgi-Apparat und dem endoplasmatischen Retikulum sowie innerhalb der Golgi-Zisternen. Durch die Unterstützung des retrograden Transports und der Sortierung von Frachtproteinen trägt COPA zur Aufrechterhaltung der Organellhomöostase, der Proteinprozessierung und der Integrität des sekretorischen Weges bei. Der COPA-abhängige Transport steht in Verbindung mit zellulären Stressantworten, einschließlich ER-Stress und Signalwegen der Unfolded-Protein-Response, und beeinflusst über Effekte auf die Proteinlokalisation auch Immun- und Entzündungssignale. Genetische Störungen von COPA wurden mit Immundysregulation und entzündlichen Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht, was COPA zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien des intrazellulären Transports und der Immunbiologie macht.

COPA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen COPA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

COPA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des COPA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der COPA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen COPA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native COPA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von COPA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des COPA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem COPA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.