COL4A5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401199-ACT

COL4A5 codifica a cadeia α5 do colágeno tipo IV, um componente estrutural central das membranas basais que se organiza em redes heterotriméricas, sustentando a arquitetura dos tecidos e a filtração seletiva. Nos glomérulos renais, na cóclea e em tecidos oculares, os arcabouços de colágeno IV contendo COL4A5 influenciam a adesão célula–matriz, a mecanotransdução e a organização da matriz extracelular, integrando-se a vias mediadas por integrinas, complexos de adesão focal e enzimas de remodelamento da matriz. Alterações na expressão de COL4A5 ou na integridade dessas redes comprometem a estabilidade e a permeabilidade da membrana basal, contribuindo para nefropatia hereditária e fenótipos sensoriais relacionados. Por isso, COL4A5 é amplamente estudado na biologia de epitélios e endotélios, na dinâmica da matriz extracelular e em modelos de disfunção da membrana basal.

COL4A5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de COL4A5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

COL4A5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus COL4A5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição COL4A5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de COL4A5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus COL4A5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de COL4A5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via COL4A5 em células tumorais com expressão de COL4A5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.