CNT2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409209-ACT

SLC28A2 codifica il trasportatore concentrativo di nucleosidi 2 (CNT2), un trasportatore ad alta affinità e sodio-dipendente che media l’ingresso cellulare di nucleosidi purinici come adenosina e inosina attraverso la membrana plasmatica. Controllando la via di recupero dei nucleosidi (salvage) e le riserve intracellulari di nucleotidi, CNT2 influenza il metabolismo energetico, la sintesi degli acidi nucleici e le vie di segnalazione purinergica che modulano le risposte cellulari allo stress. L’attività di CNT2 è particolarmente rilevante nei tessuti con elevato flusso di nucleosidi, inclusi intestino e rene, e contribuisce anche in ambito farmacologico e tossicologico, dove la gestione degli analoghi dei nucleosidi rappresenta una variabile chiave. Un trasporto di nucleosidi deregolato è stato associato ad alterazioni dello stato metabolico e a rimodellamenti legati alla malattia dell’omeostasi dei nucleotidi, rendendo SLC28A2 un bersaglio utile per studi meccanicistici dei cambiamenti di via indotti dal trasporto.

CNT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC28A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CNT2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC28A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC28A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CNT2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC28A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CNT2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CNT2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC28A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.