CHT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404869-ACT

SLC5A7 codifica o transportador de colina de alta afinidade 1 (CHT1), um transportador de solutos da membrana plasmática que medeia a captação de colina dependente de sódio como a etapa limitante da velocidade para a síntese de acetilcolina em neurónios colinérgicos. Ao controlar a disponibilidade intracelular de colina para a colina acetiltransferase, o CHT1 liga o transporte através da membrana ao ciclo das vesículas sinápticas e à neurotransmissão colinérgica sustentada. Alterações na atividade de SLC5A7 têm sido associadas a défices na sinalização colinérgica neuromuscular e central, relacionando este transportador com vias relevantes para a função motora, processos cognitivos e regulação autonómica. Como determinante da produção pré-sináptica de acetilcolina, o CHT1 é frequentemente estudado em modelos de diferenciação neuronal e em sistemas que investigam a transmissão sináptica e o acoplamento metabólico à síntese de neurotransmissores.

CHT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC5A7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CHT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC5A7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC5A7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CHT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC5A7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CHT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CHT1 em células tumorais com expressão de SLC5A7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.