Chr-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401478-ACT

CHGB codifica la cromogranina B (Chr-B), una proteina acida dei granuli secretori, arricchita nelle cellule neuroendocrine e neuronali, che supporta la secrezione regolata e la biogenesi delle vescicole a nucleo denso. Chr-B partecipa allo smistamento e alla maturazione del carico dei granuli, contribuendo all’efficienza dell’esocitosi accoppiata allo stimolo e al rilascio di ormoni peptidici/neuropeptidi. Grazie al suo ruolo nell’omeostasi della via secretoria, CHGB viene comunemente studiato in contesti che riguardano la differenziazione neuroendocrina, la funzione di vescicole simili a sinaptiche e la segnalazione calcio-dipendente legata al traffico vescicolare. Alterazioni dell’espressione o del processamento di CHGB sono state investigate in disturbi caratterizzati da disfunzione secretoria e squilibrio neuroendocrino, offrendo un punto di accesso molecolare per studi meccanicistici in modelli cellulari rilevanti per la malattia.

Chr-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHGB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Chr-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHGB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHGB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Chr-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHGB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Chr-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Chr-B nelle cellule tumorali con espressione di CHGB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.