Che-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404982-ACT

L’AATF umano codifica Che-1, un cofattore nucleare della trascrizione implicato nel coordinare la progressione del ciclo cellulare, la segnalazione del danno al DNA e le soglie apoptotiche. Che-1 interagisce con i macchinari trascrizionali e di regolazione della cromatina per modulare programmi di espressione legati alle risposte allo stress dipendenti da p53 e alla trascrizione mediata dall’RNA polimerasi II. Attraverso queste funzioni, AATF contribuisce alle decisioni cellulari tra proliferazione e arresto ai checkpoint, e la sua deregolazione è stata associata, in contesti rilevanti per il cancro, ad alterazioni dei segnali di sopravvivenza e a fenotipi di instabilità genomica. L’attività di Che-1 è inoltre studiata in relazione alla proteostasi e al metabolismo dell’RNA, a supporto del suo impiego in indagini meccanicistiche sulle vie di adattamento allo stress.

Che-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AATF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Che-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AATF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AATF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Che-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AATF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Che-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Che-1 nelle cellule tumorali con espressione di AATF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.