Ceramide Kinase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404164-ACT

Il gene umano **CERK** codifica la ceramide chinasi, una chinasi lipidica che fosforila la ceramide generando ceramide-1-fosfato (C1P), spostando l’equilibrio degli sfingolipidi dalla ceramide pro-apoptotica verso pool di C1P competenti per la segnalazione. L’attività di CERK supporta il traffico di membrana e la segnalazione infiammatoria, e interseca vie che regolano sopravvivenza cellulare, proliferazione e risposte allo stress attraverso la modulazione del metabolismo degli sfingolipidi. Controllando l’asse ceramide/C1P, CERK influenza processi quali la produzione di eicosanoidi, il trasporto vescicolare e la dinamica del citoscheletro. Una segnalazione degli sfingolipidi dipendente da CERK deregolata è stata implicata in contesti che includono la biologia del cancro, la neuroinfiammazione e la disfunzione metabolica, rendendo CERK un nodo rilevante per studi meccanicistici della segnalazione mediata dai lipidi.

Ceramide Kinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CERK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ceramide Kinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CERK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CERK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ceramide Kinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CERK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ceramide Kinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ceramide Kinase nelle cellule tumorali con espressione di CERK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.