Cdc34 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403783-ACT

O CDC34 codifica a enzima humana E2 conjugadora de ubiquitina Cdc34, um componente central dos complexos de ligase E3 de ubiquitina do tipo SCF (SKP1–CUL1–F-box), que catalisam a poliubiquitinação de proteínas regulatórias para degradação pelo proteassoma. A atividade de Cdc34 está estreitamente ligada à progressão do ciclo celular, particularmente ao controle de G1/S, ao promover a renovação de substratos-chave que regulam a replicação do DNA e a sinalização de checkpoints. Por meio de seu papel na proteostase dependente de ubiquitina, o CDC34 se conecta a vias que governam proliferação, estabilidade genômica e respostas ao estresse. A expressão alterada de CDC34 ou a desregulação do eixo SCF é frequentemente estudada no contexto de sinalização oncogênica e de outras doenças caracterizadas por programas aberrantes de degradação de proteínas.

Cdc34 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDC34 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdc34 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDC34 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDC34, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdc34. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDC34 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdc34 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdc34 em células tumorais com expressão de CDC34 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.