CCT A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404021-ACT

PCYT1A codifica la citidililtransferasi della colina‑fosfato A (CCT A), l’enzima limitante della via della CDP‑colina (di Kennedy) che genera fosfatidilcolina, un importante lipide strutturale delle membrane eucariotiche. Controllando la sintesi di fosfatidilcolina, la CCT A influenza la biogenesi di membrana, la dinamica delle goccioline lipidiche e l’omeostasi del RE e dell’apparato di Golgi, collegando la disponibilità di lipidi alla funzione degli organelli e alla crescita cellulare. L’attività di PCYT1A si integra con un rimodellamento più ampio dei fosfolipidi e con il metabolismo delle lipoproteine, plasmando la composizione di membrana e la competenza di segnalazione. Un’alterazione della funzione di PCYT1A è associata a patologie ereditarie del metabolismo dei fosfolipidi e può influire sulle risposte allo stress cellulare e sui programmi di differenziamento rilevanti per fenotipi metabolici e neuroevolutivi.

CCT A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCYT1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCT A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCYT1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCYT1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCT A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCYT1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCT A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCT A nelle cellule tumorali con espressione di PCYT1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.