CAPS-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424190-ACT

Cadps codifica a CAPS-1, uma proteína ativadora dependente de Ca2+ que promove o priming (preparação) de vesículas de núcleo denso e regula a exocitose regulada em células neuroendócrinas e neuronais. Ao coordenar a prontidão das vesículas e acoplar a sinalização por Ca2+ à secreção, a CAPS-1 sustenta a liberação de neurotransmissores e neuropeptídeos, a secreção hormonal e a função sináptica. A atividade da CAPS-1 interage com a fusão de membranas mediada por SNARE e com processos de ciclagem de vesículas pré-sinápticas que moldam a excitabilidade e a comunicação em rede. A desregulação do controle da via secretória é relevante para mecanismos estudados em fenótipos do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, bem como em defeitos de secreção endócrina, tornando o Cadps de camundongo um modelo útil para disfunção celular ligada à secreção.

CAPS-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cadps sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CAPS-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cadps em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cadps, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CAPS-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cadps nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CAPS-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CAPS-1 em células tumorais com expressão de Cadps silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.