CAPS-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424190-ACT

Cadps kodiert CAPS-1, ein Ca2+-abhängiges Aktivatorprotein, das das Priming dichtkerniger Vesikel fördert und die regulierte Exozytose in neuroendokrinen und neuronalen Zellen steuert. Durch die Koordination der Vesikelbereitschaft und die Kopplung der Ca2+-Signalgebung an die Sekretion unterstützt CAPS-1 die Freisetzung von Neurotransmittern und Neuropeptiden, die Hormonausschüttung sowie die synaptische Funktion. Die CAPS-1-Aktivität überschneidet sich mit SNARE-vermittelter Membranfusion und präsynaptischen Prozessen des Vesikelzyklus, die die Erregbarkeit und die Kommunikation in neuronalen Netzwerken prägen. Eine Fehlregulation der Kontrolle sekretorischer Signalwege ist für Mechanismen relevant, die bei neuroentwicklungsbedingten und neuropsychiatrischen Phänotypen sowie bei Defekten der endokrinen Sekretion untersucht werden; daher ist Cadps in der Maus ein nützliches Modell für sekretionsassoziierte zelluläre Dysfunktionen.

CAPS-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cadps-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CAPS-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cadps-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cadps-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CAPS-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cadps-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CAPS-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CAPS-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cadps-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.