Capicua Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406191-ACT

O gene humano CIC codifica Capicua, um repressor transcricional de ligação ao DNA do tipo HMG-box que integra a sinalização receptor tirosina-quinase–RAS–MAPK/ERK em programas de expressão gênica dependentes do contexto. Capicua restringe a expressão de ETS e de outros alvos transcricionais imediatos (immediate-early), moldando a proliferação, a diferenciação e o comprometimento de linhagem ao acoplar sinais extracelulares à repressão associada à cromatina. A interrupção ou atenuação da repressão mediada por CIC tem sido associada a alterações na saída de MAPK e à desregulação transcricional observada em múltiplos contextos tumorais, nos quais CIC pode atuar como um freio molecular sobre a sinalização oncogênica. Como resultado, CIC é frequentemente estudado em transcrição dependente de sinalização, transições de estado celular e mecanismos de reprogramação regulatória de genes impulsionada por vias de sinalização.

Capicua O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CIC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Capicua O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CIC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CIC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Capicua. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CIC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Capicua no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Capicua em células tumorais com expressão de CIC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.