Barttin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404023-ACT

Il gene umano **BSND** codifica la barttina, una subunità accessoria essenziale per i canali del cloruro **CLCNKA** e **CLCNKB**, che ne supporta il traffico intracellulare, la stabilità e la conduttanza al cloruro sulla membrana plasmatica. Il trasporto di Cl⁻ dipendente dalla barttina è fondamentale per l’omeostasi ionica epiteliale nel rene e nell’orecchio interno, collegando **BSND** alla gestione transepiteliale dei sali e all’equilibrio ionico dell’endolinfa. Attraverso la regolazione della funzione dei canali del cloruro, la barttina contribuisce ai gradienti elettrochimici che influenzano i processi di trasporto accoppiato di Na⁺/K⁺ e l’equilibrio dei fluidi. La disregolazione di **BSND** è associata a fenotipi ereditari di perdita di sali e ipoacusia neurosensoriale, rendendolo un bersaglio rilevante per lo studio dei meccanismi di trasporto epiteliale e delle relazioni genotipo–fenotipo.

Barttin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BSND senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Barttin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BSND nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BSND, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Barttin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BSND nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Barttin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Barttin nelle cellule tumorali con espressione di BSND silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.