ATP5H Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403948-ACT

ATP5H codifica una piccola subunità strutturale dell’ATP sintasi mitocondriale (Complesso V) che sostiene l’assemblaggio e la stabilità del settore F0, necessario per la produzione di ATP accoppiata al flusso di protoni. Contribuendo alla fosforilazione ossidativa, ATP5H influenza l’omeostasi energetica cellulare, il potenziale di membrana mitocondriale e l’equilibrio redox, con effetti a valle sulla segnalazione dipendente dal metabolismo e sulle risposte allo stress. Un’espressione o una funzione alterata delle subunità dell’ATP sintasi è spesso associata a fenotipi di disfunzione mitocondriale, tra cui bioenergetica compromessa e una maggiore sensibilità allo stress ossidativo, caratteristiche ricorrenti in numerosi disturbi neuromuscolari e metabolici. In quanto nodo della bioenergetica mitocondriale, ATP5H è rilevante per studi sulla regolazione della catena respiratoria, sul controllo qualità mitocondriale e sulla riprogrammazione metabolica in stati cellulari rilevanti per la malattia.

ATP5H Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP5H senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP5H Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP5H nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP5H, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP5H. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP5H nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP5H nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP5H nelle cellule tumorali con espressione di ATP5H silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.