ATP13A1 CRISPR/Cas9 케이오 플라스미드 (h): sc-409296

개요

ATP13A1은 주로 소포체(ER)에 국재하는 P5형 ATPase를 암호화하며, 지질 처리(lipid handling)를 조절하고 분비 단백질 및 막 단백질의 적절한 성숙을 지원함으로써 막 항상성과 단백질 항상성(프로테오스타시스)에 기여합니다. ATP13A1의 기능이 교란되면 소포체 기능이 흔들리고 세포 스트레스 반응이 증가하며, 핵심 클라이언트 단백질의 수송 및 세포 표면 발현이 변화할 수 있어 단백질 품질 관리와 세포내 막 역학을 조율하는 경로와의 연관성이 시사됩니다. 면역 및 조혈 맥락에서 ATP13A1은 항원 제시와 수용체 신호전달에 관여하는 구성요소를 포함한 다중통과 막 단백질의 생합성과 안정성에 관여하는 것으로 보고되었습니다. 이러한 역할로 인해 ATP13A1은 소포체 스트레스 적응 신호전달, 막 단백질 생합성, 그리고 질병 연관 프로테오스타시스 불균형의 기전을 연구하는 데 중요한 표적이 됩니다.

ATP13A1 CRISPR/Cas9 KO 플라스미드 (h)는 human 세포주에서 ATP13A1 유전자를 표적 파괴하도록 설계된 플라스미드 풀입니다. 이 풀에 포함된 각 플라스미드는 Streptococcus pyogenes Cas9 뉴클레아제와 함께 ATP13A1 유전자좌 내의 별개의 부위를 표적으로 하는 고유한 sgRNA를 공동 발현하며, 성공적으로 형질 도입된 세포를 형광으로 식별하고 농축할 수 있도록 GFP를 암호화합니다. 이 멀티 가이드 전략은 기능적 녹아웃을 유발하는 프레임 시프트 또는 결손을 유도할 가능성을 높여, 단일 가이드 접근법에 비해 더 강력한 대안을 제공합니다. 여러 부위에서 유도된 이중 가닥 절단(DSB)은 비동종 말단 결합(NHEJ)을 통해 해결되거나, 포함된 HDR 기증자 템플릿과 함께 사용될 경우 유전자좌 내의 정의된 표적 부위에서 동종 재조합에 의한 복구(HDR)를 통해 해결됩니다.

RFP 발현 HDR 도너와 함께 사용할 경우, GFP 및 RFP 형광을 함께 활용하여 형질전환된 세포 집단과 편집된 세포 집단을 구별할 수 있어, 유세포 분석 기반 선별 및 클론 선택 워크플로우를 간소화할 수 있습니다.

상동성 유도 복구(HDR) 도너 — RFP 리포터가 포함된 푸로마이신 카세트

확인되고 선택 가능한 녹아웃 클론을 필요로 하는 응용을 위해, ATP13A1 HDR 플라스미드(h)는 정의된 ATP13A1 표적 부위에 특이적인 상동성 암(homology arms)으로 둘러싸인 푸로마이신 저항성 카세트(PuroR) 및 적색 형광 단백질(RFP) 리포터를 포함하는 HDR 도너 구조체를 포함합니다.
ATP13A1 CRISPR/Cas9 KO 플라스미드 (h)와 공동 형질 도입 시:

• PuroR-RFP 카세트는 HDR을 통해 Cas9 절단 부위에 통합되어 ATP13A1의 개방형 독판(open reading frame)을 파괴합니다.
  RFP 형광은 성공적인 통합을 즉시 시각적으로 나타내므로, 푸로마이신 선별 전이나 선별과 병행하여 형광 기반의 편집된 세포 식별 또는 선별이 가능합니다.
  성공적으로 편집된 세포는 푸로마이신 내성을 통해 확인되므로, 클론 스크리닝 부담을 크게 줄여줍니다.
  이 선별 전략은 하류 기능 연구, 약물 스크리닝 또는 모델 개발을 위한 안정적인 클론 KO 세포주를 생성하는 데 이상적입니다.

Cre-lox 카세트 제거 시스템

이 HDR 기증자 구조체는 PuroR-RFP 선택 카세트를 둘러싼 loxP 사이트를 갖추고 있어, 클론 확인 후 마커를 깨끗하게 제거할 수 있습니다. 포함된 Cre 벡터: sc-418923을 통한 Cre 재조합효소의 일시적 발현은 카세트를 절제하여 ATP13A1 유전자좌 내에 최소한의 잔류 loxP 부위만 남기고, 하류 분석에 대한 잠재적인 혼동 요인을 제거합니다.
이 2단계 접근 방식:

• 국소 염색질 구조 및 인접한 조절 인자에 대한 교란을 최소화합니다
  편집된 유전자좌에서 거의 자연 상태와 유사한 게놈 환경을 복원합니다
  동일한 세포주에서 추가 편집을 위해 푸로마이신 선별 전략을 재사용할 수 있게 합니다

주요 특징

• ATP13A1 기능에 필수적인 ATP13A1 엑손을 표적화하는 gRNA
  전달 과정을 간소화하기 위해 단일 플라스미드에서 SpCas9 및 sgRNA를 공동 발현
  양성 클론 선별을 위한 푸로마이신 내성 HDR 기증자
  마커를 원활하게 제거하기 위한 Cre 재조합 효소 벡터가 포함된 loxP로 둘러싸인 PuroR 카세트
  형질전이를 통한 전달을 위해 바로 사용 가능한 상태로 제공됨

연구용으로만 사용하세요. 진단 또는 치료용이 아닙니다.