ARHGAP21 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403424-ACT

ARHGAP21 codifica una proteina attivante la GTPasi (GAP) che accelera l’idrolisi del GTP nelle GTPasi della famiglia Rho, contribuendo a coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina, la polarità cellulare e il traffico di membrana. Attraverso la modulazione della segnalazione di RhoA/Cdc42/Rac, ARHGAP21 influenza processi come la migrazione cellulare, la dinamica dell’adesione e il trasporto associato al Golgi, collegando l’organizzazione del citoscheletro alle vie di traffico intracellulare. Un’alterazione della segnalazione delle Rho GTPasi è ampiamente implicata nell’invasione delle cellule tumorali, nel comportamento metastatico e in fenotipi vascolari e infiammatori, rendendo ARHGAP21 un nodo utile per studiare il riorientamento delle vie di segnalazione in contesti rilevanti per la malattia. I ricercatori analizzano comunemente la funzione di ARHGAP21 in modelli di disregolazione del citoscheletro, programmi di transizione epitelio-mesenchimale e crosstalk di segnalazione che influenzano proliferazione e motilità.

ARHGAP21 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARHGAP21 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARHGAP21 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARHGAP21 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARHGAP21, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARHGAP21. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARHGAP21 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARHGAP21 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARHGAP21 nelle cellule tumorali con espressione di ARHGAP21 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.