APPL1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402243-ACT

APPL1 (proteína adaptadora, que interage com fosfotirosina por meio de um domínio PH e um zíper de leucina 1) é um adaptador endossomal citosólico que conecta o tráfego de membranas à transdução de sinais a jusante de receptores como os receptores de adiponectina e as vias de insulina/IGF. Ao se ligar a Rab5 e a fosfoinositídeos e ao acionar a sinalização de AKT e AMPK, a APPL1 modula a dinâmica endossomal, a homeostase da glicose e as respostas celulares a estímulos metabólicos. A sinalização dependente de APPL1 influencia a proliferação, a sobrevivência e as respostas ao estresse oxidativo por meio de PI3K–AKT e redes relacionadas. Alterações na expressão ou na função de APPL1 têm sido associadas à resistência à insulina e a fenótipos de síndrome metabólica, e ela é frequentemente estudada em contextos que conectam endocitose à sinalização oncogênica e cardiometabólica.

APPL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de APPL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

APPL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus APPL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição APPL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de APPL1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus APPL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de APPL1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via APPL1 em células tumorais com expressão de APPL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.