ALMS1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407355-ACT

ALMS1 codifica uma grande proteína associada ao centrossomo e ao corpo basal, que se localiza nos cílios primários e é necessária para a ciliogénese, o tráfego ciliar e a manutenção da organização dos microtúbulos. Por meio do seu papel na sinalização dependente de cílios, a ALMS1 influencia vias como Hedgehog e outros programas de transdução sensorial que coordenam o controlo do ciclo celular, a polaridade e a homeostase tecidular. A disfunção da ALMS1 está associada a fenótipos de ciliopatias, incluindo a síndrome de Alström, e é amplamente estudada no contexto de desregulação metabólica, degeneração retiniana, cardiomiopatia e disfunção renal. Assim, modular a expressão de ALMS1 é útil para dissecar a biologia dos cílios, o transporte intracelular e as redes de sinalização subjacentes a mecanismos de doença multissistémica.

ALMS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALMS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALMS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALMS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALMS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALMS1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALMS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALMS1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALMS1 em células tumorais com expressão de ALMS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.