Akt1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-419071-LAC

Il gene Akt1 del topo codifica una chinasi serina/treonina che funge da effettore centrale della segnalazione PI3K, integrando segnali provenienti da fattori di crescita e nutrienti per regolare la sopravvivenza cellulare, la proliferazione, il metabolismo e la sintesi proteica. AKT1 fosforila bersagli a valle, tra cui GSK3, i fattori di trascrizione FOXO e TSC2, per modulare l’attività di mTORC1, il metabolismo del glicogeno e la resistenza all’apoptosi. Nella ricerca biomedica, un’alterazione della segnalazione di Akt1 è ampiamente associata a una deregolazione della via dell’insulina/IGF, a un controllo anomalo del ciclo cellulare e a vie di risposta allo stress che contribuiscono a fenotipi rilevanti per la malattia. La connettività della sua via rende Akt1 un nodo frequentemente studiato per mappare il crosstalk tra vie di segnalazione e le conseguenze funzionali del rimaneggiamento delle reti di segnalazione in modelli cellulari.

Le particelle di attivazione lentivirale Akt1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Akt1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Akt1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Akt1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Akt1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Akt1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.