AHNAK Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425992-ACT

Ahnak codifica a AHNAK, uma grande proteína de ancoragem (scaffold) que se localiza na membrana plasmática, no citoesqueleto e no núcleo, onde coordena a montagem de complexos proteicos e a integração de sinais. Em células de camundongo, a AHNAK tem sido associada à regulação do remodelamento de actina, da adesão e migração celulares e da dinâmica de reparo de membrana, com efeitos a jusante sobre a sinalização dependente de cálcio e vias de quinases envolvidas em respostas celulares ao estresse. Por meio de interações com complexos associados à membrana e reguladores do citoesqueleto, a AHNAK influencia o comportamento de células epiteliais e imunes, incluindo alterações de polaridade, motilidade e propriedades de barreira. A expressão ou a localização desreguladas de AHNAK têm sido associadas a fenótipos proliferativos e migratórios alterados, tornando-a relevante para estudos mecanísticos em biologia do câncer, inflamação e modelos de remodelamento tecidual.

AHNAK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ahnak sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AHNAK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ahnak em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ahnak, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AHNAK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ahnak nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AHNAK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AHNAK em células tumorais com expressão de Ahnak silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.