AGR2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403036-ACT

Anterior gradient 2 (AGR2) è un fattore umano del reticolo endoplasmatico simile alle isomerasi delle proteine disolfuro, che supporta il ripiegamento delle proteine secrete e la proteostasi attraverso interazioni con le reti di chaperoni del RE. AGR2 contribuisce alla regolazione della differenziazione epiteliale, alla produzione di mucine e al mantenimento dell’omeostasi del RE, collegando la propria attività alla segnalazione della risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response, UPR) e a processi di controllo qualità dipendenti dal redox. Un’espressione alterata di AGR2 è stata associata alla biologia dei tumori epiteliali, includendo cambiamenti nell’adesione cellulare, nella migrazione e nei fenotipi secretori, rendendolo un nodo utile per studiare i programmi di adattamento allo stress e di differenziazione in modelli rilevanti per il cancro. Queste funzioni rendono inoltre AGR2 un indicatore meccanicistico in studi sullo stress del RE, sul traffico proteico e sugli stati di linea epiteliale.

AGR2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AGR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AGR2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AGR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AGR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AGR2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AGR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AGR2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AGR2 nelle cellule tumorali con espressione di AGR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.