adenosine deaminase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402201-ACT

A ADA humana codifica a adenosina desaminase, uma enzima de resgate de purinas que desamina irreversivelmente a adenosina e a desoxiadenosina em inosina e desoxiinosina, moldando os pools de purinas intra e extracelulares. Ao controlar os níveis de nucleosídeos imunomoduladores, a ADA influencia o metabolismo de nucleotídeos, o desenvolvimento de linfócitos e uma homeostase celular mais ampla ligada à replicação do DNA e às respostas ao estresse. A atividade desregulada da ADA perturba o equilíbrio e a sinalização de purinas, e a ADA é amplamente estudada em contextos em que a função de células imunes e a remodelação metabólica se cruzam. Isso torna a ADA um nó útil para investigar a comunicação cruzada entre metabolismo de purinas e imunidade e a regulação, mediada por nucleosídeos, de programas de expressão gênica.

adenosine deaminase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

adenosine deaminase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de adenosine deaminase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de adenosine deaminase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via adenosine deaminase em células tumorais com expressão de ADA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.