Adenosine A2B-R Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401402-ACT

ADORA2B codifica o receptor humano de adenosina A2B (A2B-R), um receptor acoplado à proteína G de baixa afinidade, induzido em condições de hipóxia e de stress inflamatório, quando a adenosina extracelular se acumula. O A2B-R sinaliza principalmente via Gs para aumentar o cAMP e também pode acoplar-se a Gq para mobilizar cálcio intracelular, ativando programas a jusante como PKA/CREB, MAPK/ERK e sinalização PI3K. Por estas vias, o ADORA2B modula a função de barreira endotelial, respostas angiogénicas e fibróticas e a produção de citocinas em compartimentos imunitários e estromais. A atividade desregulada de ADORA2B tem sido associada a estados inflamatórios crónicos, remodelação tecidular impulsionada pela hipóxia e sinalização no microambiente tumoral, sustentando a sua utilização como um nó mecanístico para estudos de sinalização por recetores e biologia do microambiente.

Adenosine A2B-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADORA2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Adenosine A2B-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADORA2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADORA2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Adenosine A2B-R. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADORA2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Adenosine A2B-R no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Adenosine A2B-R em células tumorais com expressão de ADORA2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.