ACOT8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407262-ACT

O ACOT8 humano codifica uma tioesterase acil‑coenzima A peroxissomal que hidrolisa ésteres de acil‑CoA em ácidos graxos livres e CoA, ajudando a equilibrar os pools de acil‑CoA e a manter a disponibilidade de CoA. Ao regular o processamento lipídico nos peroxissomos, o ACOT8 influencia a β‑oxidação de ácidos graxos, a remodelação de lipídios e a homeostase redox ligada ao metabolismo peroxissomal produtor de peróxido de hidrogênio. A atividade do ACOT8 se integra a programas metabólicos mais amplos que coordenam a comunicação entre peroxissomos e mitocôndrias e as respostas celulares ao estresse nutricional e oxidativo. Alterações no metabolismo lipídico peroxissomal e na homeostase de CoA são relevantes para disfunções metabólicas e para a biologia de doenças associadas a peroxissomos, sustentando o uso do ACOT8 como alvo em estudos de fenótipos celulares impulsionados por lipídios.

ACOT8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ACOT8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ACOT8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ACOT8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ACOT8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ACOT8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ACOT8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ACOT8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ACOT8 em células tumorais com expressão de ACOT8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.