ACO2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404434-ACT

Il gene umano **ACO2** codifica l’aconitasi mitocondriale 2, un enzima ferro-zolfo che catalizza la fase di isomerizzazione da citrato a isocitrato nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA), sostenendo così il metabolismo ossidativo e la produzione di NADH necessaria alla generazione di ATP tramite la respirazione. Collegando il flusso del carbonio all’equilibrio redox mitocondriale, ACO2 influenza la gestione delle specie reattive dell’ossigeno, l’anaplerosi e l’adattamento metabolico alla disponibilità di nutrienti. Alterazioni dell’attività di ACO2 sono state associate a fenotipi di disfunzione mitocondriale e a risposte di stress bioenergetico che si intrecciano con neurodegenerazione, miopatie e rimodellamento metabolico associato al cancro. In quanto nodo centrale del metabolismo mitocondriale, ACO2 è spesso studiato nel contesto della segnalazione dell’ipossia, della capacità di fosforilazione ossidativa e della regolazione, guidata dai metaboliti, di vie epigenetiche e di stress.

ACO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ACO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ACO2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ACO2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ACO2 nelle cellule tumorali con espressione di ACO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.