ACAT-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403419-ACT

Das humane ACAT2-Gen kodiert die Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase 2 (ACAT-2), ein membranständiges Enzym des endoplasmatischen Retikulums, das freies Cholesterin mit langkettigen Fettsäure-Acyl-CoAs zu Cholesterinestern verestert. Diese Reaktion unterstützt die intrazelluläre Pufferung von Cholesterin, die Bildung von Lipidtröpfchen und den Zusammenbau von Lipoproteinen und verknüpft die ACAT-2-Aktivität mit der Sterolhomöostase und umfassenderen Programmen des Lipidstoffwechsels. Die Funktion von ACAT-2 überschneidet sich mit Signalwegen, die den Cholesterintransport, die SREBP-regulierte Lipidsynthese und zelluläre Antworten auf lipotoxischen oder oxidativen Stress steuern. Eine dysregulierte Cholesterinester-Metabolisierung wurde mit metabolischen Phänotypen und der Biologie des kardiovaskulären Risikos in Verbindung gebracht, wodurch ACAT2 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien in hepatozyten- und intestinumrelevanten Modellen ist.

ACAT-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACAT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACAT-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACAT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACAT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACAT-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACAT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACAT-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACAT-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACAT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.