A20/TNFAIP3 CRISPR Activationプラスミド (m): sc-423436-ACT

Tnfaip3はA20/TNFAIP3をコードしており、A20はユビキチン編集酵素として、TNFR、TLR、IL-1Rなどの受容体の下流でNF-κBおよびMAPK経路の活性化を終結させることで炎症性シグナル伝達を抑制します。A20は脱ユビキチン化活性とユビキチンリガーゼ活性を協調的に働かせ、RIPK1、TRAF6、NEMOなどのシグナル伝達中間体に付加されるK63結合およびM1結合のユビキチン鎖を調節し、サイトカイン産生や免疫恒常性を形作ります。マウスの免疫系および間質系コンパートメントでは、A20機能の変化が自然免疫・獲得免疫応答の破綻、異常な細胞生存、炎症刺激への感受性亢進と関連します。そのためTnfaip3は、自己免疫、慢性炎症、ならびに状況依存的な腫瘍微小環境シグナル伝達の機序に関して広く研究されています。

A20/TNFAIP3 CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Tnfaip3の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

A20/TNFAIP3 CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Tnfaip3 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はTnfaip3転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性A20/TNFAIP3の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のTnfaip3遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるA20/TNFAIP3依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびTnfaip3発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるA20/TNFAIP3経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。