3PGDH CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401405-ACT

ヒトPHGDHは、解糖系中間体である3-ホスホグリセリン酸をL-セリンおよび下流の一炭素代謝へと振り向ける、de novoセリン生合成経路の初発かつ律速酵素である3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（3PGDH）をコードしています。PHGDHはセリンおよびグリシンプールの制御を通じて、ヌクレオチド合成、メチル化反応、さらにNADH/NADPH共役代謝を介した細胞のレドックスバランスに影響を与えます。PHGDHの発現・機能の破綻（ディスレギュレーション）は、増殖状態における代謝リプログラミングや、セリンの利用可能性がタンパク質・脂質・神経伝達物質関連の生合成過程を制限するような神経代謝表現型と関連づけられています。解糖系とアミノ酸代謝および葉酸サイクルのフラックスをつなぐ経路ノードとして、3PGDHは栄養依存性、ミトコンドリア—細胞質の代謝クロストーク、ストレス適応を扱う研究で頻繁に解析対象となっています。

3PGDH CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PHGDHの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

3PGDH CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PHGDH 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPHGDH転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性3PGDHの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPHGDH遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座における3PGDH依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPHGDH発現が沈黙または低下した腫瘍細胞における3PGDH経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。