γENaC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402577-ACT

SCNN1G codifica a subunidade γ do canal epitelial de sódio (γENaC), um canal heterotrimérico sensível à amilorida que medeia a entrada eletrogénica de Na⁺ através das membranas apicais no rim, pulmão, cólon e outros epitélios. A função do γENaC integra-se com a sinalização da aldosterona e da vasopressina para regular o transporte transepitelial de sal e água, influenciando o volume do fluido extracelular, a homeostase do líquido da superfície das vias aéreas e o equilíbrio sistémico de eletrólitos. A atividade do canal é controlada pelo processamento proteolítico, pelo tráfego dependente de ubiquitina mediado por NEDD4-2 e por vias celulares que regulam a permanência na membrana e a probabilidade de abertura. A desregulação das subunidades do ENaC, incluindo SCNN1G, está implicada em perturbações do manuseio de sal e da hidratação das vias aéreas, apoiando estudos mecanísticos em fisiologia epitelial e biologia do transporte iónico.

γENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SCNN1G sem alterar a sequência de ADN subjacente.

γENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SCNN1G em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SCNN1G, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de γENaC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SCNN1G nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de γENaC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via γENaC em células tumorais com expressão de SCNN1G silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.