Inibição de Expressão Genética Mediata por DNA Plasmídeo shRNA

• Em uma placa para cultura de seis poços, cresça as células para atingirem 50–70% de confluência em meio de crescimento sem antibiótico FBS.

OBSERVAÇÃO: Recomenda-se esse protocolo para um único poço de uma placa de cultura de 6 poços. Ajuste as quantidades de células e reagentes proporcionalmente ao número de poços ou placas de culturas de diferentes tamanhos.

OBSERVAÇÃO: São necessárias células saudáveis e subconfluentes para o sucesso do experimento de transfecção. Recomenda-se verificar a viabilidade celular um dia antes da transfecção.

OBSERVAÇÃO: A proporção ideal de DNA Plasmídeo shRNA: Reagente de Transfecção de Plasmídeo shRNA deverá ser determinada experimentalmente iniciando-se com 1 µg de DNA Plasmídeo shRNA, e entre 1.0 a 6.0 µl de Reagente de Transfecção de Plasmídeo shRNA como descrito abaixo. Uma vez identificada a proporção ideal de DNA Plasmídeo shRNA: Reagente de Transfecção de Plasmídeo shRNA para um determinado tipo de célula, a quantidade adequada do complexo DNA Plasmídeo shRNA/ Reagente de Transfecção de Plasmídeo shRNA usado por poço deverá ser testada a fim determinar qual a quantidade que garante a maior eficiência de transfecção. Por exemplo, se a proporção ideal de DNA Plasmídeo shRNA: Reagente de Transfecção de Plasmídeo shRNA for de 1 µg:1 µl, então outras quantidades entre 0.5 µg/0.5 µl a 2.0 µg/2.0 µl deverão ser testadas.

• Prepare as seguintes soluções:

  Solução A: Para cada transfecção, dilua 10 µl de DNA Plasmídeo shRNA ressuspendido (ou seja, 1 µg DNA Plasmídeo shRNA) em 90 µl de Meio de Transfecção de Plasmídeo shRNA: sc-108062

  Solução B: Para cada transfecção, dilua 1–6 µl Reagente de Transfecção de Plasmídeo shRNA: sc-108061 com suficiente Meio de Transfecção de Plasmídeo shRNA: sc-108062 para formar um volume final de 100 µl.

OBSERVAÇÃO: Não acrescente antibióticos ao Meio de Transfecção de Plasmídeo shRNA: sc-108062

OBSERVAÇÃO: Os resultados otimizados poderão ser alcançados usando-se tubos de microcentrífuga siliconizados.

OBSERVAÇÃO: Apesar de ser altamente eficaz em várias linhagens celulares, o Reagente para Transfecção de Plasmídeo shRNA: sc-108061 pode não ser compatível para o uso em algumas linhagens celulares.

• Usando uma pipeta, acrescente a solução de Plasmídeo DNA shRNA (Solução A) diretamente ao Reagente para Transfecção de Plasmídeo shRNA (Solução B) para a diluição da mesma. Misture gentilmente pipetando-se a solução para cima e para baixo, e incube a mistura por 15–45 minutos em temperatura ambiente.
• Lave as células duas vezes com 2 ml de meio para Transfecção de shRNA :sc-108062. Aspire o meio e prossiga imediatamente para o próximo passo.

OBSERVAÇÃO: Não use PBS, pois o fosfato residual pode competir com o DNA e se ligar ao Reagente de Transfecção shRNA, podendo reduzir a eficiência da transfecção.

• Para cada transfecção, acrescente 0.8 ml de meio para transfecção shRNA a cada poço.
• Acrescente 200 µl do complexo (Solução A + Solução B) DNA Plasmídeo shRNA/Reagente de Transfecção shRNA (Solução A + Solução B) gota a gota em cada poço, cobrindo-se inteiramente a placa de cultura.
• Misture gentilmente agitando-se a placa para assegurar que toda a camada de células seja imersa na solução.
• Incube as células durante 5–7 horas à temperatura de 37° C em incubadora de CO2 ou sob condições normais de cultura para as células utilizadas. Períodos longos de transfecção poderão ser necessários para algumas linhagens celulares. 
• Após a incubação, acrescente 1 ml do meio de crescimento celular contendo 2 vezes soro normal e a concentração de antibióticos necessária (2x meio de crescimento celular normal).
• Incube as células por mais 18–24 horas sob as condições normais utilizadas para a cultura das células utilizadas.

OPCIONAL: Para a transfecção temporária, aspire o meio e troque por meio fresco normal para crescimento 1x. Analise as células usando o protocolo apropriado 24–72 horas após adição do meio fresco no passo anterior.

Para selecionar as células transfectadas, prossiga com a seleção em puromicina como descrito a seguir:

OBSERVAÇÃO: A concentração de trabalho da puromicina para as células mamíferas variam de 1-10 µg/ml. Antes de usar a puromicina (sc-108071), faça a titulação para determinar a concentração ideal para a linhagem celular utilizada. Use a concentração mais baixa capaz de eliminar 100% das células não transfectadas em 3–5 dias a partir do inicio da seleção com puromicina.

48 horas após a transfecção, aspire o meio e troque por meio fresco contendo puromicina na concentração adequada.

A cada 2-3 dias, aproximadamente, aspire e troque o meio por meio seletivo recém preparado.

OBSERVAÇÃO: Os controles devidos deverão ser sempre empregados nos experimentos com shRNA. shRNA Controles encontram-se disponíveis em 20 µg. Cada controle contém sequências de shRNA misturadas que não levarão a qualquer degradação específica de nenhum mRNA celular até então conhecido. Os Plasmídeos shRNA Controles incluem : sc-108060, sc-108065 e sc-108066

OBSERVAÇÃO: Para análise via Western blot prepare o lisado celular da seguinte maneira: Lave as células uma vez com PBS. Faça a lise celular em 300 µl de Solução-tampão 1X para amostras em Eletroforese (sc-24945) agitando-se gentilmente a placa de 6 poços, ou ainda, pipetando-se para cima e para baixo. Faça a sonicação do lisado em gelo caso necessário.

OBSERVAÇÃO: Para análise via RT-PCR, isole RNA usando o método descrito por P. Chomczynski e N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159) ou usando um dos kits para isolamento de RNA disponíveis comercialmente.