UPIa Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402951-ACT

L’UPK1A umano codifica l’uroplachina-1a (UPIa), una proteina di membrana tetraspan che si assembla con altre uroplachine per formare placche uroteliali rigide sulla superficie apicale delle cellule “ombrello”. Queste placche sostengono l’integrità della barriera epiteliale e contribuiscono al traffico di membrana e ai programmi di differenziamento terminale che mantengono l’architettura specializzata delle vie urinarie. L’espressione di UPK1A è comunemente utilizzata come marcatore di linea di un urotelio differenziato e la sua disregolazione viene studiata nel contesto del rimodellamento uroteliale e della biologia del carcinoma della vescica. Una composizione alterata delle uroplachine può influenzare le interazioni cellula-cellula e l’organizzazione della membrana apicale, processi rilevanti per il fenotipo tumorale e la plasticità epiteliale.

UPIa Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UPK1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UPIa Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UPK1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UPK1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UPIa. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UPK1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UPIa nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UPIa nelle cellule tumorali con espressione di UPK1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.